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IncuCyte™ Applications : Immune Cell Killing


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What is immune cell killing?

면역세포 인식과 새로운 종양세포와 같은 원치 않는 세포에 대한 killing은 human host defense mechanism의 결정적인 요소 입니다. Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)와 T cell killing은 세포와 연관된 면역반응의 두 가지 방법 입니다. 이러한 각각의 과정은 표적 세포를 분해하는 natural killer(NK) cell이나 cytotoxic T lymphocytes(CTL) 등의 면역세포 증대를 자극합니다. 면역세포와 암세포간의 상호작용과 암세포와 싸우고 제거하는 면역체계의 능력을 복구하고 촉진시키는 과정에 대한 이해는("cancer immunotherapy" 나 "immuno-oncology") 흥미롭고 촉망되는 연구분야 입니다.


IncuCyte™ Immune Cell Killing Assay소개

면역세포와 연계된 종양세포의 killing 과정의 실시간 시각화와 자동화된 분석.

Cytotoxic T cell killing과 Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)에 이상적임.

T cell에 의한 SK-OV-3 ovarian cancer cell의 killing. 두 개의 IncuCyte™ movie anti-CD3 antibody와 IL-2에 의해 활성화된 PBMC의 T cell sub population에 의한 target SK-OV-3 tumor cell killing을 보여줌. (좌측) IncuCyte™ Caspase 3/7 apoptosis reagent를 사용해 Apoptosis가 일어나는 cell의 실시간 확인. (green fluorescence). (우측) NucLight Red™ Live-Cell Labeling Reagent를 사용하여 Red형광을 발현시킨 SK-OV-3 cancer cell을 사용하여 tumor cell proliferation의 동시 관찰.

Assay 개념

1.Target tumor cell을 사용자가 사용하고자 하는 immune cell과 co-culture. (e.g., T cells 혹은 human peripheral blood mononuclear cells; PBMCs).

2.IncuCyte™ Caspase 3/7 Reagent를 culture media상에 mix-and-read 방식으로 넣어 실시간으로 Tumor cell death를 직접 측정.

3.자동화된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 tumor cell death를 선택적으로 정량. Optional: NucLight™ Live-Cell Labeling Reagent를 사용하여 target cell을 label하여 tumor cell count를 동시에 가능.


Cancer Immunotherapy Discovery - IncuCyte™ Publications

McCormack E, Adams KJ, Hassan NJ, Kotian A, Lissin NM, Sami M, et al. Bi-specific TCR-anti CD3 redirected T-cell targeting of NY-ESO-1- and LAGE-1-positive tumors. Cancer Immunol Immunother, 62(4):773–85, 2013

Directing T cells to kill antigen expressing tumor cells using a novel T cell engaging protein. The IncuCyte™ system was used to selectively quantify the whole killing time course and revealed activities at timepoints that alternative methodologies could not detect.

Adams, KJ et al. The use of induced pluripotent stem (iPS) cells for the safety testing of enhanced affinity TCR-transduced T cells. Cancer Research, AACR; April 5-9, San Diego, CA, 2014

Testing off-target T cell activity against a panel of iPS cultures representing major organs of the human body. The IncuCyte™ system enabled direct visualization of caspase-3/7 dependent apoptosis, in real-time over a four day time course.

“Redirected killing by ImmTACs can be missed in short-term killing assays such as 51Cr-release and even the extended LDH-release assay. The adaptation and use of the IncuCyte™ technology is therefore of critical importance for assessing ImmTAC potency and specificity under the strictest possible conditions”.

Adams, K. Redirected T cell activity by high affinity TCR-Anti-CD3 Bispecific candidate therapeutics. PhD Dissertation, Cardiff University (2013)


IncuCyte™ immune cell killing assay의 Key advantages

Tumor cell killing에 대한 실시간 시각화와 완전히 자동화된 분석.

Tumor cell death와 viability에 대한 직접 측정.

높은 응용성을 가진 assay 방식을 통한 적절한 분석 수행.

스크리닝에 적합한 Mix-and-read 96/384-well assay.

Tumor cell killing에 대한 실시간 시각화와 완전히 자동화된 분석

Immune cell과 cancer cell 간의 역동적인 상호작용을 보여줌.

이미지와 동영상을 통해 phenotype을 관찰하고 morphology를 평가.

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Immune cell과 tumor cell 상호작용의 시각화. (1) 작은 크기의 cytotoxic T cell과 보다 큰 label된 tumor cell (red). T lymphocyte 분열. (2) cytotoxic T lymphocyte 의 공격을 받는 Tumor cells : The "kiss of death". (3) Tumor cell의 cytoplasmic granulation은 곧바로 caspase 3/7 labeling됨. (green), nuclear condensation과 cell death. (4) Tumor cell mitosis: 하나의 cell이 두개가 됨.

Tumor cell death와 viability의 직접적인 측정

IncuCyte™ image analysis tool을 사용해 tumor cell proliferation과 apoptosis를 선택적으로 정량.

Measure using the IncuCyte™ Caspase 3/7 Apoptosis Reagent를 사용해 tumor cell apoptosis를 측정하고, NucLight™ Live-Cell Labeling Reagent를 사용해 tumor cell proliferation을 측정.

사용자의 cell culture incubator내에서 tumor cell killing의 full time-course를 관찰. long-term study를 확실하게 수행. (>5 days)

Image

Tumor cell death와 proliferation(optional)의 실시간 측정. 사용자에게 편리한 IncuCyte™ software는 apoptotic tumor cell을 이미지 기반으로 직접 확인가능(green objects, 노란색으로 표시됨) 하며, real-time counting of live tumor cell의 실시간 counting 함. (NucLight™ red labeled nuclei, 파란색으로 표시됨). Kinetic적인 측정은 treatment에 대한 효과를 시간에 따라 보여줌.

높은 응용성을 가진 assay 방식을 통한 적절한 분석 수행

Protocol은 PBMCs, cytotoxic T lymphocyte와 NK cell과 adherent 혹은 suspension tumor cell type과의 co-culture에 맞게 개발됨.

사용자의 선택에 따른 effector와 target cell을 사용하여 T cell-mediated cytotoxicity와 antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC) 실험 수행.

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ADCC: Trastuzumab(Herceptin®) 으로 유발된 SKOV-3 ovarian cancer cell에 대한 immune cell killing. PBMCs 는 SKOV-3 NucLight™ Red(Her2-positive) 또는 A549 NucLight Red(Her2-negative) tumour cell과 co-culture됨. SKOV-3에서 trastuzumab으로 유발된 농도 의존적인 tumor cell proliferation의 저해의 Time course data. (A) A549 cell에서는 효과가 나타나지 않음 (B). SKOV-3 cell의 proliferation의 trastuzumab의 농도에 따른 반응 (C). Antibody의 유무에 따른 분석되지 않은 원본이미지와 (상단) masking된 이미지 (하단) (첨가 후 72시간, D).

스크리닝에 적합한 Mix-and-read 96/384-well assay

Washing 없이, cell 떼어내지 않고, 방사선 없이, antibody labeling 없이 수행.

설정 이후 완전히 자동화된 이미지 촬영과 분석

Flow cytometry와 end point biochemical 측정과 호환가능 – 간단히 cell과 supernatant를 assay가 끝난 시점에 harvest 가능.

일반적으로 사용되었던 immune cell killing assay

Common methods used to assess cancer cell의 immune cell killing에 대한 일반적으로 사용되었던 방법들은 주로 end-point이며 cell lifting이 필요하거나(e.g., flow cytometry) tumor cell viability나(e.g., LDH, GAPDH release assays) immune cell activation(ELISpot)에 대한 직접적인 측정이 아니었음. 또한 이러한 방법들은 대부분 이미지 기반이 아니었음. 하단의 표는 이러한 기존 방법들과 IncuCyte™를 사용한 방법들의 성능을 보여줌.

IncuCyte™ immune cell killing assays Flow cytometry 51Cr release assay GAPDH/LDH-release assay DELFIA® TRF Assays ELISpot ADCC reporter bioassay (Promega)
Real-time cell visualization 가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능
Integrated analysis 가능 가능 불가능 불가능 불가능 가능 불가능
Direct measurement of tumor cell death 가능 가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능
Tumor cell viability measurements 가능 가능 가능 가능 가능 불가능 불가능
Assess long term killing >24h 가능 가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능
Flexible choice of target and effector cells 가능 가능 가능 가능 가능 가능 불가능
ADCC and T cell killing formats 가능 가능 가능 가능 가능 가능 불가능
Mix and read, no wash 가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능 가능
384-well throughput 가능 불가능 가능 가능 가능 가능 가능
Cells can be used for further analysis 가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능 불가능
High sensitivity 가능 가능 불가능 가능 가능 가능 가능
Non-radioactive 가능 가능 불가능 가능 가능 가능 가능
No labeling antibodies 가능 불가능 가능 가능 불가능 불가능 가능